利用原代肝细胞模型检测细胞内磷酸化组蛋白H2AX表达筛选遗传毒物的方法验证

摘要：目的验证以原代小鼠肝细胞为受试细胞,以细胞内磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）表达改变为检测指标的体外检测化学物遗传毒性的实验方法。方法采用改良的两步胶原酶灌注法分离获取小鼠肝细胞,并运用三明治法体外培养肝细胞。选择4种已知的遗传毒物平阳霉素、苯并芘、苯乙烯和氧化苯乙烯及2种非遗传毒物硫唑嘌呤和环孢素A作为受试物,用受试物0~40μmol·L-1处理原代培养肝细胞0~24 h,CCK-8法检测细胞毒性,并用流式细胞术检测γH2AX的表达水平。结果利用所建立的方法筛选上述4种遗传毒物均获得阳性结果,2种非遗传毒物均呈阴性反应。直接遗传毒物平阳霉素和氧化苯乙烯作用3 h,间接遗传毒物苯并芘和苯乙烯作用6 h时,γH2AX表达量最高（P〈0.01）。4种遗传毒物处理组在最适时间点（直接遗传毒物：3 h;间接遗传毒物：6 h）及最适作用浓度（10μmol·L-1）诱发细胞γH2AX的表达水平依次为25.7,18.4,12.4和14.2（平均荧光强度）,分别为DMSO溶剂对照组的18,12,8和10倍（P〈0.01）,且γH2AX的表达水平与遗传毒物浓度呈显著正相关（P〈0.01）。非遗传毒物硫唑嘌呤和环孢素A处理组与DMSO溶剂和空白对照组相比,γH2AX的水平均无明显变化。结论利用原代肝细胞模型检测γH2AX表达水平可在无S9的情况下有效区分遗传毒物与非遗传毒物和直接遗传毒性与间接遗传毒性。γH2AX表达水平可作为鉴别遗传毒物与非遗传毒物的有效参考指标。