人源去甲肾上腺素转运蛋白稳定表达细胞系的构建及其功能鉴定

摘要：目的构建人源去甲肾上腺素转运蛋白（h NET）稳定表达细胞系,并对细胞系h NET的结合和重摄取功能进行研究。方法采用脂质体转染法将h NET转染于母细胞-人胚肾（HEK）293细胞（HEK293-h NET）;采用RT-PCR和Western蛋白质印迹法在基因和蛋白水平对HEK293-h NET细胞系进行鉴定和稳定性验证;采用放射性配基结合实验检测HEK293-h NET的结合和重摄取功能。并采用三环类抗抑郁药地昔帕明（DIM）和5-羟色胺/去甲肾上腺素双重重摄取抑制剂度洛西汀（DLX）,在0~1×10-4mol·L-1浓度梯度范围绘制药物与h NET的结合与重摄取抑制曲线,进一步验证HEK293-h NET细胞系的结合和重摄取功能。结果 RT-PCR和Western蛋白质印迹实验结果表明,所建立的HEK293-h NET细胞系在15代内均稳定表达h NET;放射性配基结合实验表明,HEK293-h NET细胞具有内源性h NET的结合和重摄取功能。并且,DIM和DLX与HEK293-h NET细胞中h NET具有明显的特异性结合（Ki值分别为2.45和3.40 nmol·L-1）,并可显著抑制h NET对去甲肾上腺素的重摄取作用（IC50分别为5.78和10.23 nmol·L-1）。结论成功建立的可稳定表达h NET的HEK293-h NET细胞系具有内源性h NET的结合和重摄取功能,可用于h NET靶标药物研究。