去甲斑蝥素作用早期对人肝癌细胞活性氧及NF-E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路的激活

摘要：目的探究去甲斑螯素（NCTD）诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡及G2/M期阻滞的早期事件,分析NCTD作用早期Hep G2细胞内活性氧自由基（ROS）的变化规律及NCTD对NF-E2相关因子/抗氧化反应元件（Nrf2/ARE）信号通路的影响。方法 NCTD30,60和120μmol·L（-1）分别作用于体外培养的人肝癌Hep G2细胞3,6,12,24,48和72 h,MTT法检测NCTD对细胞存活的影响;流式细胞术检测NCTD60μmol·L（-1）作用细胞12,24和48 h对细胞周期和细胞凋亡的影响;DCFH-DA探针结合流式细胞术检测NCTD 30,60和120μmol·L（-1）作用于3,6和12 h对Hep G2细胞内ROS的影响;荧光素酶法测定NCTD同时转染ARE和荧光素酶报告基因的Hep G2C8细胞的荧光强度;实时荧光定量PCR检测对血红素氧合酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶-1（NQO1）m RNA表达的影响。结果 NCTD 30,60和120μmol·L（-1）作用3和6 h对Hep G2细胞存活无明显影响,而作用24,48和72 h对Hep G2细胞有明显生长抑制作用（P〈0.01）;NCTD 60μmol·L（-1）作用12 h后可诱导Hep G2细胞发生凋亡及G2/M期阻滞,12,24和48 h凋亡细胞比例分别由12 h细胞对照组（4.00±1.98）%增加到（12.10±1.70）%,24 h对照组（4.05±0.21）%增加到（31.80±6.50）%,48 h对照组（3.90±0.85）%增加到（33.30±1.41）%;12,24和48 h G2/M期细胞比例分别由12 h对照组的（16.51±1.58）%增加到（40.89±0.18）%,24 h对照组的（16.99±1.32）%增加到（55.29±3.99）%,48 h对照组的（14.45±0.59）%增加到（50.66±5.88）%,相应各时相NCTD处理组G1期细胞比例明显下降（P〈0.01）;NCTD 30,60和120μmol·L（-1）作用Hep G2细胞3,6和12 h,ROS无明显变化,作用Hep G2C8细胞6和12 h可明显激活Nrf2/ARE信号通路,下游基因HO-1和NQO1 m RNA表达显著上调（P〈0.05）。结论NCTD作用Hep G2细胞早期可明显激活Nrf2/ARE信号通路;ROS激活可能不是NCTD诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡及G2/M期阻滞的主要原因。