毛蚶抗癌活性蛋白对K562细胞增殖和凋亡的影响

摘要：目的考察毛蚶抗癌蛋白（ASAP）活性组分体外对人慢性粒细胞性白血病K562细胞的细胞毒作用,初步探讨其作用机制。方法 ASAP由毛蚶软体经常规低温水提和硫酸铵沉淀法制备;Bradford法测定ASAP样品的蛋白质浓度,计算蛋白质含量;倒置相差显微镜下观察ASAP作用后K562细胞形态变化,姬姆萨染色观察细胞和细胞核的变化;MTT法检测ASAP对K562细胞存活的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化;Western蛋白质印迹法检测细胞凋亡和细胞周期相关蛋白胱天蛋白酶原3（35 ku）,胱天蛋白酶3（17 ku）,程序性细胞死亡因子4（PDCD4）和P53的表达。结果 MTT实验结果表明,ASAP 50,100和200 mg·L^-1作用24-72 h对K562细胞增殖具有明显的抑制作用,呈时间和浓度依赖性,24,48和72 h的浓度-效应相关系数分别为0.851,0.8977和0.8997（P〈0.01）。镜下观察发现,ASAP 200 mg·L^-1作用48 h,K562细胞出现变形或核碎裂等形态变化。流式细胞术结合姬姆萨染色显示,ASAP可浓度依赖性地引起K562细胞凋亡和G2/M期阻滞,其中ASAP 200 mg·L^-1处理48 h,K562细胞早期凋亡率为（32.8±0.1）%〔对照组（3.7±1.1）%〕（P〈0.01）,晚期凋亡率为（31.2±2.2）%〔对照组（9.9±0.8）%〕（P〈0.01）;G2/M期细胞为（55.2±1.7）%〔对照组（15.3±0.8）%〕（P〈0.01）。Western蛋白质印迹法实验结果显示,ASAP作用0-40 h,K562细胞中胱天蛋白酶原3（32 h时）明显下调（P〈0.01）,胱天蛋白酶3表达明显增加（P〈0.01）,而随着ASAP作用时间的延长,PDCD4和P53蛋白表达均下调（P〈0.01）。结论诱导K562细胞凋亡和G2/M期阻滞可能是ASAP细胞毒作用的主要机制;ASAP诱导的细胞凋亡是胱天蛋白酶3通路依赖的,诱导K562细胞凋亡和G2/M期阻滞可能与PDCD4和P53蛋白表达下调相关。