CYP3A4高表达肝细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响

摘要：目的建立CYP3A4高表达肝细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法PCR扩增CYP3A4基因并将其克隆到慢病毒高表达载体中，将已经构建的慢病毒载体进行转染后，收集病毒上清，感染正常L02肝细胞。用嘌罗霉素进行筛选得到CYP3A4高表达肝细胞株，通过荧光定量PCR和Western蛋白质印迹法鉴定细胞株。用三氯乙烯0，0．25，0．5，1．0，2．0和4．0mmol·L^-1对正常肝肝细胞和CYP3A4高表达肝细胞进行染毒12h，实时定量PCR检测凋亡基因bcl-2，胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9以及癌基因C-fos，C—myc，K-ras和p53的表达。结果测序证明重组慢病毒高表达载体CYP3A4基因序列正确，荧光定量PCR检测CYP3A4高表达肝细胞株比正常肝细胞CYP3A4基因表达提高94倍。Western蛋白质印迹结果显示，CYP3A4高表达肝细胞株CYP3A4蛋白表达水平是正常肝细胞的2．36倍。CYP3A4高表达肝细胞bcl-2mRNA表达水平随三氯乙烯浓度增加呈下降趋势，与正常细胞相比，三氯乙烯0．25和0．5mmol·L^-1使CYP3A4高表达肝细胞中的bcl-2mRNA明显升高（P〈0．01）；三氯乙烯0．5，1．0，2．0和4．0mmol·L^-1处理使CYP3A4高表达肝细胞组的凋亡基因胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表达水平明显升高（P〈0．05）；三氯乙烯0．5，1．0，2．0和4．0mmol·L^-1处理的CYP3A4高表达肝细胞C-fos、C—myc和k-ra$基因的表达显著升高（P〈0．01），庙3表达水平明显下降（P〈0．01）。结论三氯乙烯对CYP3A4高表达肝细胞株中的凋亡基因和癌基因表达具有明显促进作用，说明CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素。