preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

摘要：目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白（前S1蛋白＋前S2蛋白＋S蛋白）的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1（1-174），HBsAg2（1-245），HBsAg3（1-294），HBsAg4（1-341），HBsAg5（1-373），HBsAg6（1-400），最终累加成一条连续的长链状态，贯穿在细胞内外形成四次跨膜区，并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3．1-preSl．preS2-HBsAg中扩增出前S1，S2基因，采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽＋6×组氨酸（His）＋前S1蛋白、前S2蛋白＋HBsAg（1-6）＋血细胞凝集素（HA）；PCR产物经XhoI和＆0RI双酶切后插入经同样处理的真核表达载体plRES2一EGFP，构建含有Pro-UK，6×His，preSl，preS2，HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP／Pro-UK-6xHis-preS1-preS2-HBsAg（1～6）-HA，该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞，经G418加压筛选阳性克隆，并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果PCR结果显示，电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600，810，957，1098，1194和1275bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞，呈亮绿色，细胞形态良好，荧光表达强度高；Westerm印迹结果显示，在相对分子质量31000，34000，44000，47000，54000和60000处有明显的阶梯状蛋白信号，条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体，并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。