基于高内涵分析方法建立稳定共表达人δ阿片受体与 PKAcat-EGFP的CHO细胞模型

摘要：目的 利用高内涵分析(HCA)方法用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞建立人δ阿片受体(hDOR)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基(PKAcat)融合蛋白(PKAcat-EGFP)稳定共表达的细胞模型,为体外高通量筛选作用于hDOR的药物及药物分子机制研究奠定基础.方法 通过脂质体介导法将潮霉素B抗性的hDOR重组质粒(pcDNA3.1/Hygro(+)-hDOR)转染入已稳定表达PKAcat-EGFP的CHO细胞中,随后用含潮霉素B的选择性培养基培养细胞,有限稀释法挑取耐药单克隆,PKA重分布实验筛选阳性克隆,利用Z′因子对建立的细胞模型的可靠性进行评价,利用PKA重分布实验与LANCE cAMP 384试剂盒检测受体功能.结果 PKA重分布实验与LANCE cAMP 384试剂盒检测结果表明,CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3号克隆反应性良好,特异性DOR激动剂SNC80100 nmol·L-1作用时的Z′平均值为0.615,表明该细胞模型可靠,经多次传代后,细胞中的hDOR在40代以内能保持稳定表达,SNC80可浓度依赖性地激活细胞上的hDOR,其EC50值为(6.192±1.225)×10-9 mol·L-1.结论 成功建立了hDOR与PKAcat-EGFP融合蛋白稳定共表达的细胞模型CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3.